近年來，特色地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品受到消費者的青睞。我國高端豬肉的推廣具有地域性。目前市場上推廣了許多地理標(biāo)志豬肉，比如北京黑六、萊蕪豬、巴彥豬肉等。地域特色豬肉的產(chǎn)地保護(hù)，是保障其品質(zhì)的重要方法，可使企業(yè)與消費者建立信賴關(guān)系。產(chǎn)地溯源是產(chǎn)地保護(hù)的重要手段。現(xiàn)在報道的產(chǎn)地溯源技術(shù)主要有穩(wěn)定同位素溯源技術(shù)[1]，礦物元素指紋分析技術(shù)[2]，近紅外光譜技術(shù)[3]，核磁技術(shù)[4]，有機(jī)成分指紋分析[5]，DNA 技術(shù)等[6-8]。

礦物元素分析被認(rèn)為是食品產(chǎn)地溯源最為可靠的技術(shù)手段之一[9]。生物體內(nèi)的礦物元素組成受氣候、環(huán)境、生物代謝類型等因素的影響。在不同地理生態(tài)環(huán)境下，生物體中礦物元素含量存在差異。礦物元素含量與多元統(tǒng)計分析結(jié)合，是實現(xiàn)礦物元素評估驗證生物樣品來源的重要手段。常采用的統(tǒng)計分析手段有方差分析、多重比較分析、主成分分析、聚類分析、判別分析等[10-13]。

目前國內(nèi)該類技術(shù)大多應(yīng)用在植物源性農(nóng)產(chǎn)品中，比如水果蔬菜、谷物、茶葉等[14-17]。在動物源性食品中的應(yīng)用主要有羊肉[18,19]，牛肉[20,21]，雞肉[22,23]等。目前礦物元素指紋技術(shù)應(yīng)用到豬肉產(chǎn)地溯源的研究較少。豬的飼養(yǎng)方式存在差異性和復(fù)雜性，目前，有研究探索喂養(yǎng)方式與豬肉中礦物元素含量之間的相關(guān)性[24,25]。這些研究可以為豬肉的產(chǎn)地溯源提供一定依據(jù)。韓國的Kim Kyong Su 在豬肉產(chǎn)地溯源方面研究較多[26-28]。2017 年，Kim Kyong Su 通過豬肉中多種礦物元素含量將韓國豬肉與進(jìn)口的美國、德國、澳大利亞、荷蘭、比利時的豬肉進(jìn)行了區(qū)分，判別率達(dá)到97%。2018 年，Kim Kyong Su 將礦物元素和碳氮同位素比率聯(lián)用對韓國和非韓國的豬肉進(jìn)行判別，判別率達(dá)到了100%。目前我國對豬肉的產(chǎn)地溯源研究較少。地理標(biāo)志豬肉為保證其地域?qū)傩?，一般不存在異地調(diào)種、異地育肥的問題。因此地域信息的干擾少，礦物元素指紋分析可作為其產(chǎn)地溯源的可靠技術(shù)手段。

本文主要針對具有特色地域標(biāo)志的高品質(zhì)豬肉開展研究。通過對四川巴山的青峪黑豬肉，山東萊蕪黑豬肉和北京黑六豬肉中33種礦物質(zhì)元素含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，初步探索礦物元素含量在中國地域特色豬肉產(chǎn)地溯源中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試豬肉材料為四川青峪黑豬后腿肉（n=10）（巴中市巴山牧業(yè)股份有限公司），山東萊蕪黑豬后腿肉（n=6）（得利斯集團(tuán)萊蕪畜牧科技有限公司）和北京黑六黑豬后腿肉（n=10）（北京黑六牧業(yè)科技有限公司）。

濃硝酸（優(yōu)級純）、30%雙氧水（優(yōu)級純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；33種元素多元素混標(biāo)（10 μg/mL），SCP SCIENCE；去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm，20 ℃），費爾德Field-X 純水機(jī)；In、Ge、Rh、Re 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L），Inorganic Ventures。

1.2 儀器與設(shè)備

TOPEX+智能型微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；ICAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），賽默飛世爾科技。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取新鮮豬后腿肉瘦肉部分，切成小塊，放入絞肉機(jī)絞拌均勻。稱取0.5000 g 左右樣品，置于微波消解管中，加入6 mL 硝酸和2 mL 雙氧水，按照微波消解程序進(jìn)行消解。消解后得到澄清溶液，趕酸后用超純水定容至15mL，待測，高含量元素經(jīng)稀釋后測量。飼養(yǎng)用水，取5 mL 加2 mL 硝酸，按照微波消解程序進(jìn)行消解，趕酸后用超純水定容至15 mL 待測，高含量元素經(jīng)稀釋后測量。每個樣品稱量2 個平行試樣。微波消解升溫條件如表1 所示。

表1微波消解條件
Table 1 Temperature programming of Microwave Digestion

1.3.2 樣品分析

測定樣品中Na、K、Mg、Ca、B、Ti、Al、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Li、Be、V、Cr、Ni、Mo、Ag、Cd、Sr、Sn、Sb、Ba、La、Ce、Pb、U、Tl、Bi 共33 種元素含量。

用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，用10 μg/L Rh、Re、In、Ge 內(nèi)標(biāo)元素保證儀器的穩(wěn)定性。ICP-MS 儀器條件如表2 所示。

表2ICP-MS 儀器條件
Table 2 Instrument Conditions of ICP-MS

表333種元素檢出限
Table 3 Detection Limit of 33 elements

表4 不同產(chǎn)地豬肉中無機(jī)元素含量
Table 4 Elements concentration of pork from different origins

注：表格中的數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

檢出限的測定：在與分析實際樣品完全相同的條件下，連續(xù)測量試劑空白11 次，計算試劑空白觀測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，3 倍Sb 除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率b，即為方法檢出濃度。按照稱樣量0.5g，定容體積15 mL 計算得出方法檢出限。應(yīng)用安捷倫MassProfiler Professional軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和主成分分析以及支持向量機(jī)、決策樹、樸素貝葉斯、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分類分析；用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析[29]；用上海易算生物科技有限公司的悟空：快速查看與分析數(shù)據(jù)云平臺對數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA 和OPLS-DA 判別分析（https://www.omicsolution.org/wkomics/main）。

2 結(jié)果與討論

2.1 豬肉中元素含量分析

2.1.1 豬肉中各元素含量

ICP-MS具有靈敏度高，可同時分析多種元素，分析耗時短等優(yōu)點。ICP-MS法目前成為多元素測定領(lǐng)域最先進(jìn)，最準(zhǔn)確的分析方法。肉類樣品中無機(jī)元素含量最多的是鉀，其次是鈉，多價金屬鎂、鈣、鋅、鐵的含量也較多，其他的金屬含量較少。含量少的元素，有的低于或接近檢出限，不適用于元素含量的測定和分析。因此本文分析了該測定方法各元素的檢出限，以排除豬肉樣品中含量低于或接近檢出限的元素。各元素檢出限見表3。根據(jù)各元素檢出限，篩選出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、K、Na、Mg 共13個元素進(jìn)行統(tǒng)計分析。以上13種元素含量見表4。數(shù)據(jù)顯示，豬肉樣品中，K 含量最高，一般在3000～3500 mg/kg，其次是Na，含量在300～500 mg/kg 之間，然后是鎂，含量在200～250 mg/kg 之間，Ca、Fe、Zn 含量為幾十毫克每千克，Rb 和Sr 含量為幾毫克每千克，其他元素含量較低。每種元素含量的變異系數(shù)均不大，說明豬肉樣品個體間礦物元素含量受干擾因素影響較小，樣本的代表性相對合理。

2.1.2 豬肉樣品中礦物元素的地域差異性分析

對13 種元素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，樣品中Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr 共8 種元素在地域之間差異顯著（p＜0.05）。LSD 法多重比較分析結(jié)果見表5，其中LSD0.05表示顯著水平為0.05 時的最小顯著差。計算兩組平均數(shù)的差值（?a-?b），如其絕對值大于LSD0.05 即表示在0.05水平上差異顯著；反之，則在0.05 水平上差異不顯著。如果差異顯著，兩組平均數(shù)差值為正，則a 組顯著高于b 組，反之，則a 組顯著低于b 組。LSD0.05代表差異顯著差值，LSD0.01代表差異極顯著差值。結(jié)果顯示（見表5），四川青峪豬肉中Se 和Na 含量顯著極高于其他兩地豬肉。這主要是受地理條件的影響。從各養(yǎng)殖基地采集的飼養(yǎng)用水中元素含量結(jié)果顯示（結(jié)果見表6），四川青峪豬肉飼養(yǎng)用水中Na 含量明顯高于其他兩地。從我國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院發(fā)布的中國土壤硒元素含量分布圖中可以看出，四川達(dá)州位于四川東部大巴山腹心地帶，地處川渝鄂陜四省市結(jié)合部，土壤富硒。萊蕪黑豬肉中Co含量顯著高于其他兩地豬肉，與飼養(yǎng)用水中Co元素含量結(jié)果顯示一致。萊蕪黑豬肉中Rb 和Sr 含量顯著低于其他兩地豬肉，北京黑六豬肉中Zn 和Fe 含量顯著低于其他兩地豬肉，這些結(jié)果可能與其他環(huán)境因素息息相關(guān)。

表5 LSD 法多重比較分析結(jié)果表
Table 5 LSDmethod multiple comparison analysis results

注：表格中LW 代表萊蕪黑豬，HL代表北京黑六黑豬，QY 代表四川青峪黑豬。

表6 不同產(chǎn)地豬飼養(yǎng)用水中無機(jī)元素含量
Table 6 Elements concentration in feeding water of pork from different origins

注：表格中的數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，“/”未檢出。

2.2 豬肉中元素含量的主成分分析

主成分分析通過降維的作用，利用少數(shù)的幾個綜合指標(biāo)反映眾多指標(biāo)的信息，從而把樣品中多元素信息更直觀的表現(xiàn)出來。通過主成分分析的結(jié)果也可以判斷篩選的特征元素的差異情況。對在2.1中篩選出的，豬肉中具有地域間顯著差異的8 種元素進(jìn)行主成分分析。結(jié)果表明（見圖1），前三個主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為53.33%、26.11%、9.00%，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到88.44%，能夠達(dá)到充分反映原始數(shù)據(jù)信息的目的。從前三個主成分的3D得分圖可以看出，利用第一主成分、第二主成分、第三主成分可以區(qū)分不同地區(qū)的豬肉樣品。從主成分的特征向量（表7）可以看出，其中第一主成分主要綜合了樣品中Na、Fe、Co、Cu、Zn 和Se 六種元素含量的信息。第二主成分主要綜合了樣品中Rb 和Sr 含量的信息。第三主成分主要綜合Na、Co、Cu 和Se 元素含量的信息。

表7 第一、第二和第三主成分的載荷
Table 7 Loading of first three principal components PC1, PC2, PC3

2.3 產(chǎn)地的不同分類模型分析

2.3.1 偏最小二乘法判別分析和基于正交信號校正的偏最小二乘判別分析

偏最小二乘法判別分析是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法。PLS-DA 和OPLS-DA 對于小樣本量和較少自變量的數(shù)據(jù)的分析具有一定的優(yōu)勢。圖2中橘色區(qū)域LW 代表萊蕪黑豬，藍(lán)色區(qū)域HL 代表北京黑六，灰色區(qū)域QY 代表青峪黑豬。從圖2 中可以看出，橘色區(qū)域和灰色區(qū)域有重疊部分，且較為分散。采用留一法進(jìn)行交叉驗證，從交叉檢驗結(jié)果（見表8）可以看出，雖然北京黑六和四川青峪黑豬的預(yù)測完全正確，但萊蕪黑豬被錯誤預(yù)測到其他組中。與PLS-DA 相比較，OPLS-DA 加了正交校正之后數(shù)據(jù)檢出假陽性會降低，所以會更準(zhǔn)確。圖3 中綠色區(qū)域QY代表青峪黑豬，紅色區(qū)域LW 代表萊蕪黑豬，藍(lán)色區(qū)域HL代表北京黑六。從OPLS-DA 得分圖中能明顯看出三地豬肉樣品被完全區(qū)分開。其中R2X 和R2Y 表示模型與實驗觀測值的相關(guān)性，即表示擬合程度的好壞，R2越接近1 模型對樣本的擬合能力越強(qiáng)，相關(guān)性越大。Q2Y 則為通過交叉驗證計算得出，用以評價模型的預(yù)測能力，數(shù)值越接近1 說明模型預(yù)測能力越好，通常情況下，R2、Q2Y 高于0.5較好，且兩者差值越小代表預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果越接近。RMSEE 表示模型的計算值與樣本真實值的偏離度。RMSEE 越小越好[31]。評價模型優(yōu)劣的統(tǒng)計量分比為R2X=0.854，R2Y=0.809，Q2Y=0.771，RMSEE=0.208。OPLS-DA判別方法可以得到100%的交叉驗證準(zhǔn)確率。綜合看來模型并未過擬合，且有較好的預(yù)測能力。

圖1第一、第二和第三主成分標(biāo)準(zhǔn)化3D 得分散點圖
Fig.13DScore Scatter plot of first three principal components
PC1, PC2 and PC3

圖2第一、第二主成分PLS-DA 得分圖
Fig.2Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

圖3第一、第二主成分OPLS-DA 得分圖
Fig.3Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

表8PLS-DA 對不同產(chǎn)地豬肉判別結(jié)果表
Table 8 PLS-DA discriminant result table for pork from different producing areas

表9不同分類模型的交叉驗證結(jié)果
Table 9 Accuracy of the prediction algorithm by cross-validation

表10 不同分類模型的外部測試集驗證結(jié)果
Table 10 Accuracy of the prediction algorithm by External validation set

2.3.2 其他分類模型我們還應(yīng)用支持向量機(jī)（Support Vector Machine）、決策樹(Decision Tree)、樸素貝葉斯（Naive Bayes）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Neural Network）四種分類方法，建立預(yù)測模型，考察其預(yù)測的準(zhǔn)確率。采用留一法進(jìn)行交叉驗證，測試算法準(zhǔn)確性。其中支持向量機(jī)的交叉驗證結(jié)果的準(zhǔn)確率為100%，決策樹的交叉驗證準(zhǔn)確率為88.46%，樸素貝葉斯的交叉驗證準(zhǔn)確率為92.31%，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的交叉驗證準(zhǔn)確率最低。此外，林昕等[30]在研究化學(xué)計量學(xué)工具在基于礦物元素指紋分析的茶葉產(chǎn)地溯源中應(yīng)用的結(jié)果也顯示，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的驗證準(zhǔn)確率一般相較于決策樹要低。通過外部驗證數(shù)據(jù)驗證模型的準(zhǔn)確性。驗證結(jié)果顯示（見表10），決策樹分類模 型能夠?qū)⑷齻€類別的樣品全部準(zhǔn)確歸類。四種分類模型中，決策樹分類模型結(jié)果最優(yōu)，這也與林昕等[30]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

3.1通過對三種不同地域來源的地理標(biāo)志豬肉中礦物元素含量的測定，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析，篩選出有效地域判別元素指標(biāo)，初步確定了礦物元素指紋分析對我國豬肉產(chǎn)地溯源的可行性。根據(jù)肉類樣品中某些礦物元素含量極低的特點，通過檢出限的測定，篩除了一些含量極低的不適合做統(tǒng)計分析的元素指標(biāo)。通過方差分析，篩選出Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr共8 種元素在三地豬肉之間差異顯著。通過多重比較分析，將各元素間差異與地理環(huán)境因素相互對應(yīng)。為了進(jìn)一步了解和驗證利用礦物元素含量對特色地域豬肉進(jìn)行產(chǎn)地溯源的可行性，用8 個具有地域顯著差異的元素構(gòu)建分類模型。判別分析是一種根據(jù)觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對象如何分類的常用統(tǒng)計分析方法。我們選擇了PLS-DA，OPLS-DA，支持向量機(jī)、決策樹、樸素貝葉斯和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)六種分類方法。對比發(fā)現(xiàn)，OPLS-DA 和支持向量機(jī)交叉驗證準(zhǔn)確率達(dá)到100%，較適合應(yīng)用于利用礦物元素指紋分析的特色豬肉產(chǎn)地溯源。通過結(jié)合礦物元素含量分析和化學(xué)計量學(xué)分析手段，可實現(xiàn)三個不同地域來源的地理標(biāo)志豬肉的產(chǎn)地溯源。

3.2 本研究通過對小樣本和地理區(qū)分明顯豬肉樣本進(jìn)行初步探索研究，得到礦物元素指紋分析可較好的進(jìn)行地域判別的效果。礦物元素指紋分析是一種有效的溯源技術(shù)，能夠反映環(huán)境地理因素差異，該技術(shù)對我國豬肉進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究可靠性高，在我國豬肉的產(chǎn)地溯源和特色地理標(biāo)志性豬肉保護(hù)中具有廣泛應(yīng)用前景。